本公司提供复制缺陷型腺病毒载体和辅助病毒依赖型腺病毒载体（Ad5和Ad5/F35两种血清型）构建、扩增及纯化服务，包括从实验设计到载体包装、生产、纯化、质量检定、分装等的一系列服务。建立了成熟稳定的病毒载体构建、体外重组、细胞包装、重组腺病毒扩增、氯化铯超速离心纯化的方法和工艺，系统的腺病毒载体质量控制、鉴定方法和流程。能够为实验室基础研究、临床前研究和早期临床研究提供各种规格滴度和纯度的腺病毒载体构建和制备服务，客户在1-3个月内可得到10¹²~10¹³ vp/ml的复制缺陷型腺病毒载体，客户在3-4个月内可得到10¹¹~10¹³ vp/ml的辅助病毒依赖型腺病毒载体。

    1) 复制缺陷型腺病毒载体（Replication-deficient recombinant adenoviral vector，rAd）：原理是通过同源臂重组的方式在细菌中获得重组腺病毒基因组质粒：将克隆外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的骨架质粒共转化RecA⁺细菌，在细菌RecA重组酶的作用下经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其线性化后转染293细胞包装和扩增重组病毒。本方案采用包装重组腺病毒的经典方法，成熟可靠，成功率高。采用本方案获得的复制缺陷型重组腺病毒具有多个突出优点：①宿主范围广，能感染分裂和非分裂细胞；②转基因容量大，可以插入7.5kb的外源基因；③；可获得较高病毒滴度（10¹⁰～10¹¹ vp/ml），纯化后可达10¹²～10¹³ vp/ml；④不整合到染色体中，无插入致突变性，操作和使用风险较小。

    2) 辅助病毒依赖型腺病毒载体（Helper-dependent adenoviral vector，HDAd），俗称为“无肠型（gutless）”载体，仅含有腺病毒复制和包装的顺式作用元件即复制信号（ITRs）和包装信号（y），缺乏所有腺病毒编码基因，其优点有：①安全性好，HDAd感染细胞后，不具备复制能力，不能合成或表达任何腺病毒结构和功能蛋白，也不存在回复为复制型腺病毒（Replication competent adenovirus，RCA）的可能性；②HDAd不在感染细胞内合成（de novo）腺病毒的结构和功能蛋白，可避免机体产生抗腺病毒免疫应答，克服机体对病毒载体的免疫清除作用，使HDAd在细胞内可长期存在；③HDAd可转移的转基因容量高达37 kb，能同时表达多种抗原和基因；④宿主范围广，能感染分裂和非分裂细胞。

 

图1：复制缺陷型重组腺病毒载体制备原理图

图2：辅助病毒依赖型腺病毒载体制备示意图

 

  重组腺病毒质粒的制作：

    ◇ 制作插入目的基因的重组腺病毒穿梭质粒

    ◇ 制作和确认重组腺病毒质粒（目的基因的全碱基序列）

  重组腺病毒包装制备：

本公司提供以下两种腺病毒制备方法：非纯化重组腺病毒制备（适于细胞实验）和纯化的重组腺病毒制备（适于临床前细胞实验和动物体内实验），可满足不同客户需要。

    ◇ 线性化含有目的基因的重组腺病毒基因组导入293细胞

    ◇ 得到10⁶ -10⁸pfu/ml、5~10 ml的病毒液

    ◇病毒滴度测定、RCA检测、目的基因确认

    ◇ 制备过程需要约45个工作日

    ◇ 病毒大量制备

    ◇ 使用CsCl梯度离心纯化精制病毒溶液

    ◇ 可得到10¹¹ -10¹² vp/ml、2~3 ml病毒液

    ◇ 同时进行病毒滴度测定、RCA检查、目的基因确认

    ◇ 制备过程需60个工作日

备注：病毒滴度测定使用本公司Ad Rapid Titer Kit检测试剂盒，采用抗体检测方法，能够快速准确的检测病毒感染细胞的活力。RCA检测即Replication-competent Adenovirus检测，采用腺病毒液感染非293细胞，培养5~7天后观察是否有细胞CPE现象，如果没有出现CPE现象，则认为腺病毒液中不含有能够自我复制的病毒体。 目的基因确认采用目的基因特异性PCR检测病毒制备液。

服务说明：

1.我们接收的样品形式为：含有目的基因的质粒或菌种（目的基因名称和序列），如需代为制备克隆需额外付费，价格参见基因克隆服务部分。

2.目的基因内部不能含有Pac I和Pme I酶切位点。

收费标准与实验周期：

提供结果：

◇ 含有目的基因的穿梭质粒20 μg。

◇ 含目的基因的重组腺病毒粘粒20 μg。

◇ 制作非纯化重组腺病毒：重组腺病毒液，10⁶-10⁸ Pfu/ml、约5~10 ml。

◇ 制作纯化后的重组腺病毒：纯化重组腺病毒液, 10¹⁰~10¹² VP/ml、2~3 ml病毒液。

◇ 实验报告(包括具体实验步骤、实验照片等)。

◇ 本项目制作的重组腺病毒被用于商业目的时，需要签署单独的许可协议。

◇ 腺病毒是感染人类的病毒，要求插入基因的全序列已知，并且能够判断其基因的毒性或者病原性是安全的，可按P2的水平对待。

◇ 病毒包装周期较长，部分实验可由于基因本身结构和序列造成病毒基因组不稳定导致包装失败，仍需收取30-50%的实验费用。